mRNA疫苗相关产品-起发生物
一、mRNA疫苗生产可分为两大块:mRNA制备和脂质微粒进行包封
mRNA疫苗生产可分为两大块,可以类比为“原料药"(mRNA)的生产和纯化,以及“制剂"(利用脂质微粒进行包封)阶段。原料药(mRNA)生产涉及DNA原液制备和mRNA原液的制备,mRNA原液的制备(体外转录),是整个mRNA工艺流程中核心的步骤,而原料主要是酶。
(一)mRNA疫苗的生产
mRNA疫苗生产可分为两大块,原料药(mRNA)的生产以及制剂(利用脂质微粒进行包封)阶段。mRNA生产涉及DNA原液制备和mRNA原液的制备。所以mRNA疫苗的生产可分为三大阶段,第一步DNA原液制备,第二步mRNA原液的制备,第三步是利用脂质微粒进行包封。
第一步:DNA模板生产,主要是质粒生产。编码抗原的DNA模板生产,常用大肠杆菌大规模体内表达,最后提取和纯化携带目的序列的质粒;
第二步:mRNA原液的制备转录,由DNA到mRNA。在无细胞的反应器内进行转录,通过T7、SP6或T3等RNA多聚酶作用,通过一步或者两步法转录成为mRNA,同时加上5’的Cap及3’的PolyA尾巴,在进一步使用DNA酶将残留的DNA模板进行消除;纯化,使用离子交换等层析步骤进一步将转录形成的mRNA进行纯化,进行超滤浓缩形成原液;
第三步:制剂阶段,利用脂质微粒进行包封。通过微流体泵精确地控制着mRNA原液和脂质流速,将他们混合成脂质纳米粒LNP。最后则是成品的灌装及质量控制,贴签形成终产品。
二、mRNA合成过程所需原料
(一)国内外mRNAxin冠疫苗的合成工艺
BioNTech/辉瑞、Moderna和艾博生物mRNA疫苗的合成工艺如下:
1)BNT162b2–BioNTech/辉瑞
三核苷酸cap1类似物((m27,3′-O)Gppp(m2'-O)ApG)(TriLink)和N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸(m1ψTP)(ThermoFisherScientific)取代尿苷-5′-三磷酸(UTP)的存在下,通过T7RNA聚合酶对DNA进行纯化和体外转录。
总结:转录采用一步法,帽子类似物作引物;甲基假尿苷取代尿苷。
2)mRNA-1273–Moderna
利用优化的T7RNA聚合酶介导的转录反应在体外合成了编码序列优化的mRNA,尿苷被N1-甲基假尿苷wan全取代。转录后,使用牛痘苗封盖酶(新英格兰生物实验室)和痘苗2′O-甲基转移酶(新英格兰生物实验室)将Cap1结构添加到5’端。通过oligodT亲和纯化纯化mRNA,通过切向流过滤将缓冲液交换到pH为5.0的醋酸钠中,无菌过滤,并在-20°C下冷冻,直到进一步使用。
总结:转录采用两步法,需要加帽酶的参与,甲基假尿苷取代尿苷。
3)ARCoV-艾博生物
该mRNA在体外使用T7RNA聚合酶介导的转录从质粒ABOP-028(GENEWIZ)的线性化DNA模板中产生,该质粒编码SARS-CoV-2的密码子优化RBD区域,并包含5’和3‘的未翻译区域(UTR)和一条poly-a尾巴,以未修饰的NTP作为原料和T7聚合酶体外进行mRNA的合成,使用了牛痘加帽系统(VacciniaCappingSystem)(Novoprotein)进行加帽。
总结:转录采用两步法,需要加帽酶的参与。
(二)mRNA制备过程原料
mRNA制备过程需要用到的主要原料包括质粒DNA模板、一系列酶(主要为7种酶)以及底物核苷酸等;
1、模板DNA所需原料:质粒
DNA模板生产,主要是质粒的生产。编码抗原的DNA模板,通过质粒转染到大肠杆菌大规模体内表达,最后提取和纯化携带目的序列的质粒,即得到DNA模板。目前质粒的生产提取和纯化工艺很成熟,可以自建生产线或者外包出去,例如辉瑞自建质粒生产工厂,大部分mRNA企业外包,Moderna和国内企业目前是外包。
制备mRNA质粒的要求:质粒用于制备mRNA,这类DNA本身不属于API,DNA需要按照GMP规范进行,GMP质粒要求生产设备必须是专用的、符合GMP规范且配备洁净间。
2、mRNA体外转录所需原料:一系列酶+核苷酸底物
mRNA疫苗的研发与生产需要一系列酶的参与:mRNAT7聚合酶、无机焦磷酸酶、RnaseInhibitor、加帽酶以及2′O-甲基转移酶、Poly(A)聚合酶和DNAase等主要7种酶。
如下表:
产品编号 | 产品名称 | 品牌 |
78MRNA-1001 | ATP-Solution(100mM) | BIOHUB |
78MRNA-1002 | CTP-Solution(100mM) | BIOHUB |
78MRNA-1003 | GTP-Solution(100mM) | BIOHUB |
78MRNA-1004 | UTP-Solution(100mM) | BIOHUB |
78MRNA-1005 | NTPBundle(100mM) | BIOHUB |
78MRNA-1101 | N1-Methyl-Pseudo-UTP(100mM) | BIOHUB |
78MRNA-1102 | Pseudo-UTP(100mM) | BIOHUB |
78MRNA-1103 | RNaseInhibitor-recombinant(40000U/mL) | BIOHUB |
78DA10001 | RecombinantRNaseInhibitor(Porcine)(40000U/mL) | BIOHUB |
78MRNA-1104 | T7RNAPolymerase(1KU/μL) | BIOHUB |
78MRNA-1105 | Vaccinia CappingEnzyme(10KU/mL) | BIOHUB |
78MRNA-1106 | mRNACap2´-O-Methyltransferase(50U/μL) | BIOHUB |
78MRNA-1107 | EGFPmRNA(Pseudouridine,Ψ) | BIOHUB |
78MRNA-1109 | InorganicPyrophosphatase | BIOHUB |
78MRNA-1110 | BIOHUB | |
78MRNA-1111 | BIOHUB | |
78MRNA-1112 | 5-Methyl-CTP(100mM) | BIOHUB |
78MRNA-1113 | 5-Methoxy-UTP(100mM) | BIOHUB |
2.1转录过程所需要的酶
RNA聚合酶体系:RNA聚合酶是体外转录mRNA的关键酶。
T3、T7和SP6RNA聚合酶分别对T3、T7和SP6噬菌体启动子具有高度的特异性。将目的基因序列克隆到T7和SP6启动子下游的多克隆位点中,以克隆的DNA为模板体外合成相应的RNA。
T7RNAPolymerase(T7RNA聚合酶)【78MRNA-1104】高度特异识别T7启动子序列,以含有T7启动子序列的单链或双链DNA为模板,以核甘酸(NTP)为底物,合成与启动子下游的单链DNA互补的RNA。
无机焦磷酸酶【78MRNA-1109】:加入无机焦磷酸酶,增加RNA产量。无机焦磷酸酶(PPase)可催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐,可以为蛋白、RNA和DNA的生物合成反应提供动力,促进产物的生成。在工业化生产mRNA疫苗的时候会产生大量的无机焦磷酸盐,为了保证mRNA疫苗高效生产,可以添加无机焦磷酸酶,可解除生成的无机焦磷酸盐对反应体系的抑制。
RNase抑制剂【78MRNA-1103/78DA10001】:防止RNA的降解。少量RNase在RNA制备过程中引入,会导致RNA的降解,污染可能通过实验过程中使用的枪头、试管(离心管)和其他试剂引入。通常使用RNase抑制剂作为减少和控制此类污染物的预防措施。
RNase抑制剂能与RNaseA形成1:1复合体,抑制RNase活性,在mRNA疫苗研发和生产过程需要保持mRNA的稳定性以保证疫苗高质量的生产。
2、转录所需材料-核苷酸和修饰核苷酸
mRNA疫苗研发中常进行假尿嘧啶化修饰,尿嘧啶修饰是zui丰富的RNA修饰,一般由尿苷的异构化产生,mRNA的假尿嘧啶化修饰主要有三个功能:改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。
3、加帽和加尾:共转录加帽/模板加尾,转录后加帽/加尾
真核生物体内会对转录形成的mRNA进行加帽,即在mRNA的5’端添加一个甲基化的鸟苷酸帽子(m7GPPPN结构),从而保护mRNA免遭核酸外切酶的攻击以增加mRNA的稳定性,并且协助mRNA与核糖体的结合以促进翻译起始。生物体内的帽子结构有cap0,cap1,cap2三种形式,牛痘病毒加帽酶能够在mRNA的5’端添加cap0帽子,再使用甲基转移酶处理即可得到cap1帽子。
此外,5'帽子还参加mRNA前体的剪接,参与mRNA3'末端多聚腺苷酸化,保证mRNA在细胞质中的稳定运输。
加帽需要的酶:牛痘病毒加帽酶
可以将7-甲基鸟苷帽结构(m7Gppp,Cap0)加到RNA的5末端,大幅提高mRNA的稳定性和启动mRNA的翻译。牛痘病毒加帽酶能够在一小时之内对mRNA进行加帽,效率接近100%。
在mRNA疫苗研发生产过程中,mRNA加帽效率和加帽mRNA稳定表达的效率对疫苗的工业化生产有重大的影响。牛痘病毒加帽酶体系加帽的mRNA在细胞内的表达效率大于帽子类似物mRNA的表达效率。
加尾酶:Poly(A)聚合酶
Poly(A)聚合酶可以催化ATP以AMP的形式依次掺入到RNA的3末端,即在RNA的3末端加多聚A尾。Poly(A)尾巴能够增强mRNA的稳定性、提高翻译起始效率、引导mRNA出核。
主要用到的酶:
1)牛痘病毒加帽酶【78MRNA-1105】:
2)痘苗2′O-甲基转移酶【78MRNA-1106】
3)Poly(A)聚合酶
加帽酶非常昂贵,如何替代加帽酶?
一步法合成mRNA疫苗产品的加帽可以在mRNA的体外转录过程中通过掺入“帽子序列"实现,这种加帽技术会将加帽序列反向加在mRNA上,在反应体系中加入5’帽类似物,可以省一个加帽酶,以及减少纯化步骤,一定程度上降低成本(尤其是节省了昂贵的加帽酶成本),但相对应地,产量较之两步法(加帽酶参与)减少,因为加帽酶的加帽效率更高。
4、消除DNA模板:需要DNA酶【78MRNA-1110】
合成后的产物可能会有DNA残留,在疫苗开发阶段,残留的去除是关键的步骤,以减少下游纯化难度并增加产品的纯度。需要用DNA酶(DNAase将残留的DNA模板进行消除,在mRNA疫苗生产的过程中对DNA的残留控制非常严格格。
二、关于递送系统(LNP)原料
mRNA分子量大、亲水性强,但自身的单链结构致使其极为不稳定,易被降解,自身携带负电荷,穿过表面同为负电荷的细胞膜递送是难题,所以需要特殊的修饰或包裹递送系统才能实现mRNA的胞内表达,递送技术是mRNA公司的核心专li技术。
脂质纳米颗粒(Lipidnanoparticle,LNP)是目前主流的递送载体方式。由于其比较容易被抗原呈递细胞吸收,因此最常被用于疫苗,目前三大mRNA疫苗ju头企业,Moderna、CureVac和BioNTech xin冠疫苗均采用了LNP递送技术。
此外还有阳离子脂质复合物(lipoplex,LPX)、脂质多聚复合物(lipopolyplex,LPP)、聚合物纳米颗粒(Polymernanoparticles,PNP)、无机纳米颗粒(Inorganicnanoparticles,INP)阳离子纳米乳(Cationicnanoemulsion,CNE),以及瑞博生物自主研发的GalNacN-乙酰半乳糖胺技术,能够进行肝脏的定点传递。
(一)LNP为主流的递送载体方式
zui广泛应用的LNP组成成分:聚乙二醇脂质、胆固醇、合成磷脂、可电离阳离子脂质、mRNA。目前上市的mRNA疫苗成分主要有以下5种:
1)mRNA;
2)阳离子脂质,与带负电的mRNA结合,LNP最关键的成分;
3)胆固醇,介导LNP内吞,以及稳定LNP结构(胆固醇有助于增加细胞膜的流动性或硬度,加入胆固醇能提高纳米颗粒的稳定性);
4)磷脂酰胆碱,辅助型脂质,可以在内吞时加快mRNA的释放;
5)聚乙二醇化磷脂,延长代谢时间,提高LNP稳定性。
1、阳离子脂质体:LNP最关键的成分,是LNP逃离内体的关键成分
目前Moderna、辉瑞、BioNTech,Curevac,Acuitas,Genevant等公司都自行筛选或授权从其他公司购买的阳离子类脂质分子作为主要递送材料,每家公司材料具体结构各不相同,但都属于特定条件下戴正电荷的阳离子脂质。
阳离子脂质体开发,在递送效率和细胞毒性之间平衡。可电离阳离子脂质作用是LNP递送系统的关键,提高mRNA的体内稳定性,并帮助mRNA逃避溶酶体的降解。
在生产原液时,将mRNA和阳离子脂质体在特定PH值下混合一起,则阴离子mRNA就会和阳离子脂质体产生静电吸引融合在一起,一旦LNP被细胞吸收,核内体的低pH环境将会融合LNP,从而释放mRNA进入胞质溶胶。
阳离子脂质作为载体有着广阔的应用前景,一些阳离子脂质会引起细胞毒性。阳离子脂质的细胞毒性取决于其亲水性头基的结构,含有季铵头基的两亲分子比含有叔胺的两亲分子毒性更大。阳离子有细胞毒性,解决对人体的副反应是关键,可电离阳离子脂质是LNP技术的核心,也是专li保护的重点。
2、非阳离子脂质:胆固醇,介导LNP内吞,稳定LNP结构
胆固醇有利于确保LNP的双层结构及脂质的流动性。中性脂质(如各种磷脂)也是用于构建LNP双层结构的,因为阳离子脂质体的双层结构并不稳定。
3、PEG-lipid:
PEG修饰的脂质体形成亲水保护层,维持LNP空间的稳定性,聚乙二醇在颗粒表面可屏蔽血浆蛋白等成分结合颗粒,以避免LNP颗粒在体内被清除。
PEG-脂质结合物也可能引起不期望的毒性,含有PEG的LNP已知脂质结合物与免疫细胞相互作用,产生针对某些聚乙二醇化脂质的不希望出现的抗体。
4、磷脂酰胆碱,辅助型脂质,可以在内吞时加快mRNA的释放。
5、其他赋形剂:有利于稳定pH、温度等。
(二)LNP递送系统专li壁垒
LNP递送系统的核心壁垒其实是材料的专li。Arbutus公司在2009年持有的US8058069号专li和2015年在中国申请的CN1021192178专li对于核酸和阳离子脂质混合物进行了非常全面的保护,对于几乎所有阳离子脂质和核酸和混合物,都进行了覆盖,预计到2029年到期,到期之前专li保护难以撼动。
069核心专li内容:
包含一种或多种活性剂或治疗剂的新型稳定脂质颗粒、制备脂质颗粒的方法和递送和/或施用脂质颗粒的方法;更具体地,包含核酸(例如一种或多种干扰RNA)的稳定核酸-脂质颗粒(SNALP)、制备SNALP的方法和递送和/或施用SNALP的方法;一种核酸-脂质颗粒,包括:
(a)核酸;
(b)占颗粒中总脂质的50mol%至65mol%的阳离子脂质;
(c)包含磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物的非阳离子脂质,其中磷脂占颗粒中存在的总脂质的4mol%至10mol%,胆固醇或其衍生物占颗粒中存在的总脂质的30mol%至40mol%;
(d)抑制颗粒聚集的缀合脂质,其占颗粒中总脂质的0.5mol%至2mol%
(三)脂质包封过程所需原料
1、LNP递送系统的关键原料:可离子化脂质、PEG脂质、DSPC脂质、胆固醇。
LNP直径为80-100nm,每个脂质纳米粒含有约100个mRNA分子。以ModernamRNA-1273疫苗为例:脂质壁由四种不同的化合物组成,
1)SM-102——专有阳离子脂质,是构成纳米颗粒壁的基本结构
2)DSPC——磷脂酰胆碱,助力纳米颗粒的壁结构
3)胆固醇——胆固醇存在于人体所有的细胞膜中,根据温度的不同,胆固醇有助于增加细胞膜的流动性或硬度,加入胆固醇能提高纳米颗粒的稳定性。
4)PEG-2000DMG——一种融于聚乙二醇的脂质,能帮助纳米颗粒的形成。
专有阳离子脂质ALC-0315(辉瑞)和SM-102(Moderna)这两种脂质都是叔胺,在低pH值下质子化(因此带正电),在mRNA传递后实现安全清除。PEG脂质都是PEG-2000结合物。
LNP和mRNA的颗粒是通过自组装形成,通过两种液体按照适当的的流速和配比形成。基本原理:T型管一端是RNA的水溶液,一端是脂质的乙醇溶液,通过两相的快速混合,从而让LNP完成自主装,需要控制水相和乙醇相的流速比,设计管道的形状。
脂质体的结构在很大程度上取决于它们的制备方法。脂质体可以是直径20-100nm的单层(小的单层)囊泡(SUV),直径为100-1000nm的大单层囊泡(LUV)-1000nm或直径>1000nm的巨大单层囊泡(GUV)或直径>500nm的多层囊泡(MLV)。药物输送系统主要使用SUV和小型MLV,而GUV主要用作细胞模型。粒径是决定脂质体药物包封率和循环半衰期的一个关键参数,较小的脂质体更有可能逃脱吞噬细胞的摄取。
脂质纳米颗粒生产过程:LNP是在低pH(pH4.0)下制备的,此时可电离脂质带正电荷,因此它很容易与每个脂质纳米粒约100个mRNA分子形成复合物。微流控装置用于将水中含有mRNA的流与乙醇中含有脂质混合物的流混合。当快速混合时,这两种流的成分形成纳米粒,将带负电的mRNA包埋。
如何组装LNP是mRNA疫苗生产最大的Know-how,需要控制LNP的组分、粒度、流量、流体形态等参数,来完成结构复杂的纳米微粒组装。目前从微流控到T型混合装置核心技术掌握在极少数企业手中。
BioNTech/Pfizer xin冠疫苗的纳米脂质体颗粒(LNPs)生产采用冲击式射流混合法,,采用高压泵,让mRNA溶液和脂质体溶液形成两股射流,在一个腔体中进行对冲,从而产生剧烈的湍流。这种湍流能让LNP各个组分充分地混合,从而形成包裹mRNA的纳米脂质体。
采用德国Knauer研发生产的IJM(碰撞喷射混合器)。规模化生产的冲击式射流混合器结构和参数是根据Moerna、BioNTech等企业需求量身定制。