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牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL)说明书
真核生物中mRNA经转录后修饰在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其由D1和D12两个亚基组成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性，可将7-甲基鸟嘌呤帽结构（m7Gppp）连接到RNA的5'末端（m7Gppp5'N）。牛痘病毒加帽酶，在合适浓度的加帽缓冲液（Capping buffer），鸟苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等存在条件下，能够在一个小时之内对RNA进行加帽，并且保证正确的方向。
本品以无菌液体形式提供，可应用于体内/体外翻译前mRNA的加帽反应或mRNA的5'末端标记反应。
产品组分
组分名称 | 产品编码/规格 | ||
78MRNA-1105A（500 U） | 78MRNA-1105B（2000 U） | 78MRNA-1105C（10000 U） | |
10×Capping Buffer | 150 ul | 500 ul | 1.25 mL×2 |
SAM(32mM) | 50 ul | 200 ul | 1 ml |
RNase free water | 1ml | 1ml | 1mlx3 |
Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL) | 50 ul | 200 ul | 1 mL |
产品性质
来源（Source） | 携带牛痘病毒加帽酶基因的E. coli |
最适温度（Optimum Temperature） | 37℃ |
储存缓冲液（Storage Buffer） | 20 mM Tris-HCl pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，0.1% Triton X-100，50%甘油 |
活性单位定义（Unit Definition） | 37℃条件下，1小时内将10 pmol GTP（α- 32P）掺入到一条含80个核苷酸（80 nt）转录产物上所需要的酶量，即为1个单位。 |
产品应用【 加帽反应 】适用于10 μg RNA（≥100 nt）的加帽反应，反应体系20 μL，且可根据实验需要放大。1. 取10 μg RNA，用RNase free water将适量RNA稀释至15 μL；2. 将RNA置于65℃加热5 min，结束后冰上放置5 min；3. 按照右侧表格依次加入各组分；4. 37℃反应30 min；5. RNA加帽完成，可进行后续实验。
| 组分 | 体积 |
| Denatured RNA | 15 ul |
| 10×Capping Reaction Buffer | 2 ul |
| GTP (10 mM) | 1 ul |
| SAM (2 mM) | 1 ul |
| Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) | 1 ul |
| Total volume | 20ul |
【 5′ 末端标记反应 】本步骤适用于 5′末端带有三磷酸的RNA标记，且可根据实验需要放大。其标记效率受反应体系中RNA与GTP摩尔浓度比以及RNA样本中GTP含量影响。1. 用RNase Free Water将适量RNA稀释至14 μL；2. 将RNA置于65℃加热5 min，结束后冰上放置5 min；3. 按照右侧表格依次加入各组分；4. 37℃孵育30 min；5. RNA 5′末端标记完成，可进行后续实验。
| 组分 | 体积 |
| Denatured RNA | 14 ul |
| 10×Capping Reaction Buffer | 2 ul |
| GTP Mix | 2 ul |
| SAM (2 mM) | 1 ul |
| Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) | 1 ul |
| Total volume | 20 ul |
*注：GTP Mix为GTP和少量标记物，GTP储液应稀释为反应体系中mRNA摩尔浓度的1~3倍。 注意事项：（1）用于加帽反应的RNA在使用前应进行纯化并溶解于RNase free water 。溶液中不能含有EDTA和盐。（2）加帽酶反应前加热RNA可以去除转录产物5′的二级结构。如果转录产物的5′端结构复杂，可将加热时间延长至10 min。（3）如果转录产物的5′端结构复杂，为提高加帽效率可将反应时间延长至120 min。（4）SAM在室温下会逐渐降解，SAM降解会导致N 7 甲基化效率降低，会进一步导致加帽失败，因此需始终放置在冰上。此外，也可以通过体系优化适当提高用量以保证加帽反应顺利进行。 其他用途可参考上述用途或相关文献资料进行实验
运输和保存方法
干冰运输。-20 ºC保存，避免反复冻融，有效期1年。
注意事项
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
2. 所提取的RNA需经过纯化并使用无核酸酶的水重悬；
3. 在加入酶之前需要对RNA溶液进行加热以去除5'末端的二级结构；
4. 对于已知5'末端结构的RNA，可以延长反应时间至60分钟，提高加帽效率；
5. 5'末端标记反应体系中，GTP储液应稀释为反应体系中mRNA摩尔浓度的1-3倍。
| 货号 | 品名 | 规格 | 品牌 |
| 78MRNA-1105A | 牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL) | 500 U | BIOHUB |
| 78MRNA-1105B | 牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL) | 2000 U | BIOHUB |
| 78MRNA-1105C | 牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL) | 10000 U | BIOHUB |
