充分溶解并混匀PCR反应所需的各种溶液。将2x 长片段PCR 扩增 预混液( long fragment PCR Master Mix)置于冰浴上或冰盒内。参考下表在冰上设置PCR反应:
Component | 20uL RXN | 25uL RXN | 50uL RXN | Final Concentration |
2x 长片段PCR 扩增 预混液 | 10uL | 12.5uL | 25uL | 1 × |
10uM Forward Primer | 0.4uL | 0.5uL | 1.0uL | 0.2uM |
10uM Reverse Primer | 0.4uL | 0.5uL | 1.0uL | 0.2uM |
Template DNA | variable | variable | variable | variable |
Nuclease-Free Water | to 20uL | to 25uL | to 50uL |
|
2 . 不同模板最佳反应浓度有所不同,反应体系推荐模板使用量可参见下表。
Template DNA | 20uLRXN | 25uL RXN | 50uL RXN |
Genomic DNA | 4ng-0.4ug | 5ng-0.5ug | 10ng-1ug |
Plasmid or Vrial | 4pg-4ng | 5pg-5ng | 10pg-10ng |
cDNA | 4pg-0.4ug | 5pg-0.5ug | 10pg-1ug |
3. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀,室温离心数秒,使液体积聚于管底。
反应程序
1 .退火温度应根据引物Tm值进行调整(50-72℃)。
2. 延伸时间需根据扩增片段的长度和复杂性进行调整。
3. 各设置好的PCR反应管置于PCR仪上,开始PCR反应。
STEP | TEMP | TIME |
Initial Denaturation | 98°C | 30 sec |
25–35 Cycles | 98°C | 10 sec |
| 50–72 °C | 15 sec |
| 72°C | 15-30 sec/kb |
Final Extension | 72°C | 5 min |
Hold | 4–10 °C | ∞ |