Femto ECL 特超敏发光液说明书

Femto ECL 是一款具有特超高灵敏度的增强型化学发光(ECL)底物，也是我们ECL发光液中的灵敏度非常好的化学发光底物，由于采用了核心技术基于“荧光震荡"机理设计的发光底物系统。可通HRP实现实现低飞克级(以HRP浓度为准)的免疫印迹检测，其灵敏度，发光时间和背景均明显优秀。

其他所需材料

• 已完成转印的印迹膜：用合适的电泳法分离蛋白质，并将这些蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。

• 稀释缓冲液：使用Tris或磷酸盐缓冲液。

• 洗涤缓冲液：将5mL 10%的Tween-20加入1000mL稀释缓冲液（Tween-20的终浓度将0.05%）。

• 封闭试剂：将0.5mL10%的Tween-20加入100mL的封闭缓冲液，选择一种与稀释缓冲液具有相同基本组分的封闭缓冲液。

• 一抗： 选择一种目标蛋白质特异性抗体。使用稀释缓冲液制备该抗体的储存液。使用封闭试剂将抗体从储备液稀释成抗体工作液。最佳稀释度取决于一抗和膜上的抗原量。

• HRP标记的二抗：选择一种与二抗特异性结合的HRP标记二抗，使用稀释缓冲液制备该抗体的储存液。使用封闭试剂将抗体从储备液稀释成抗体工作液。稀释度介于1:100000和1:500000之间或抗体工作液浓度为2～10ng/ml。该浓度范围在使用链亲和素-HRP时也适用。二抗的最佳稀释度取决于HRP标记二抗和膜上的抗原量。

• 用于处理放射显影胶片的胶片暗盒、显影和定影试剂

• 用于孵育的旋转摇床。

蛋白印迹法详细操作步骤

1) 将印记膜从蛋白转印设备中取出，加入合适的封闭液在温室下孵育20-60分钟，同时振荡。以封闭膜上非特异性蛋白结合位点。请注意：使用在前文建议的抗体稀释度是非常重要的。

2) 将膜从封闭液中取出，与一抗工作液在温室孵育1小时，同时振荡；或在28℃孵育过夜，不振荡。

3) 将足量的洗涤缓冲液加至膜上，保证缓冲液将膜wan全覆盖。振荡孵育≥5分钟，更换洗涤缓冲液并重复该步骤4-6次。增加洗涤缓冲液体积，洗涤次数和洗涤时间有助于降低背景信号。

注：孵育前，膜在洗涤缓冲液中的短暂淋洗会提高洗涤效率。

请注意：使用在前文建议的HRP标记二抗稀释度是非常重要的。

4) 将HRP标记的二抗工作液与膜在温室孵育1小时，同时振荡。

5) 重复步骤3，以除去未结合的HRP标记二抗。注：膜与HRP标记二抗孵育后必须进行彻di洗涤。

6) 将A溶液与B液等比例混合，制备成工作液。每cm2膜使用0.01～0.1ml工作液。工作液可以在温室下稳定8小时。注：暴漏雨日光或任何其他强光下可能损害工作液，为获得最佳结果，将此工作液保存在琥珀色瓶中，并避免长期暴漏雨任何强光。实验室的常见照明不会损害工作液。

7) 将印记膜在工作液中孵育5分钟。

8) 从工作液中取出印记膜，并置于一个塑料片或清洁的塑料纸（膜）中，用一张吸水纸吸除多余的液体，并从印记和塑料纸之间小心地压出气泡。

9) 将包在塑料纸（膜）中的印记膜置于胶片暗盒中，蛋白质面朝上，除适用于胶片曝光的灯（如红色安全灯）之外，关闭所有的灯。

注;胶片必须在曝光期间保持干燥，为获得最佳效果，采取以下措施：

*   确保将多余的底物从膜和塑料纸上wan全去除。

*   在整个胶片处理期间，使用手套。

*   切莫将印记膜置于已显影的胶片上，因为胶片上的化学物质会减弱信号。

10) 将X光胶片置于膜的上面。建议第一次曝光60秒。之后可调整曝光时间以达到最佳结果。化学发光反应在底物孵育后的前5-30分钟期间是zui强烈的。这一反应可以持续几个小时，但强度会随时间下降，如有底物孵育后较长时间后曝光，曝光时间可能需要延长以获得较强信号。如果使用磷光存储成像设备（如Bio-Rad的分子成像仪系统）或CCD照相机可能需要较长的曝光时间。

   警告：胶片与膜之间的任何移动可能在胶片上造成人为的非特异信号。

11) 使用合适的显影剂和定影剂对胶片进行显影。如果信号太强，则缩短曝光时间或将印记膜进行剥离并降低抗体浓度重新检测。