Alamar Blue 阿尔玛蓝细胞增殖及毒性检测试剂说明书

产品描述

  阿尔玛蓝（Alamar Blue）是一种细胞活力检测试剂，包含一种具细胞膜渗透性、无毒性且弱蓝色荧光的指示剂，即刃天青 （resazurin）。自从1993年开始刃天青就作为一种值得信赖和可靠的试剂被引用。阿尔玛蓝是MTT（噻唑兰）的有效且无毒 替代物。阿尔玛蓝能定量检测人、哺乳动物、细菌、真菌和支原体细胞的增殖情况，也能用于细胞因子生物活性、细胞活力分 析、体外细胞毒性确定以及细胞生长监测。

工作原理

刃天青（resazurin）是一种氧化还原（REDOX）指示剂，根据细胞代谢还原情况发生颜色变化。氧化态的刃天青呈紫蓝色且基本无荧光，其还原态产物试卤灵（resorufin）转变为粉红色且高度荧光，产生的荧光强度与呼吸活细胞数量呈正比。通过检测 ，呼吸过程中氧化水平，阿尔玛蓝用作一种定量检测细胞活力和毒性的直接指示剂。阿尔玛蓝的颜色变化可通过普通分光光度计 检测吸光度变化，检测波长为570nm，参考波长为600nm；阿尔玛蓝的荧光变化可通过荧光光度计检测，激发波长在 530~560nm之间，发射波长为590nm。

操作说明

一、制作标准曲线（测定最佳孵育时间和细胞数量）

1. 每孔加入100微升细胞悬液（对数生长期细胞），对细胞计数。按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。注：设置阴性对照：细胞培养基中不加入细胞；阳性对照：100微升100%还原型Alamar Blue（不含细胞）。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue，阳性对照孔中加入10微升无菌的超纯水。

3. 放入细胞培养箱内培养（37℃,5% CO2）一定时间，培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

4. 推荐用荧光分光光度计检测，激发光波长在530-560 nm之间，发射光波长为590 nm。

5. 普通分光光度计在570nm测定吸光度，参考波长600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

6. 绘制标准曲线。以细胞数量或孵育时间为横坐标（X轴），Alamar Blue还原率为纵坐标（Y轴）。根据此标准曲线可以测定出适合的细胞数量或孵育时间（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致）。

a）公式 1：通过吸光值来计算还原率

Alamar Blue 还原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-（E600′×C570）] ×100；

E600=氧化态 Alamar Blue 在 600nm 波长的消光系数；

E570=氧化型 Alamar Blue 在 570nm 波长的消光系数；

A600=检测孔在 600nm 波长的吸光值；

A570=检测孔在 570nm 波长的吸光值；

E570′=还原态 Alamar Blue 在 570nm 波长的消光系数；

E600′=还原态 Alamar Blue 在 600nm 波长的消光系数；

C570=阴性对照孔在 570nm 波长的吸光值（不加细胞的培养基+Alamar Blue）；

C600=阴性对照孔在 600nm 波长的吸光值（不加细胞的培养基+Alamar Blue）；

b）公式 2：通过荧光值来计算还原率

Alamar Blue 还原率（％）=（实验组 FI 590-阴性对照组 FI 590）/（100%还原态 Alamar Blue 阳性对照 FI 590-阴性对照组 FI 590）×100

FI 590=590nm 发射波长（560nm 激发波长）下的荧光强度；

6. 绘制在每个特定细胞密度或孵育时间 Alamar Blue 的还原率。

a）对确定最佳细胞密度的实验，以细胞密度的对数（log）为 x 坐标，Alamar Blue 还原率为纵坐标；

b）对确定最佳孵育时间的实验，以孵育时间为 x 坐标，Alamar Blue 还原率为纵坐标；

c）根据以上曲线图来确定最佳细胞密度或孵育时间。

二、细胞毒性和细胞增殖检测

1. 每孔加入100微升细胞悬液（对数生长期细胞），对细胞计数。建议细胞数量为104/ml，具体每孔需要的细胞数量，需根据细胞类型决定。

2. 细胞中加入待检测药物，为检测药物对细胞增殖的作用，请设置合适的对照组，包括刺激细胞和非刺激细胞。

3. 混匀，放入细胞培养箱内孵育（37℃,5% CO2）一段时间。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。阳性对照孔中加入10微升无菌的超纯水。

5. 放入细胞培养箱内孵育（37℃,5% CO2）4-8h，最佳孵育时间取决于细胞类型。培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

6. 推荐用荧光分光光度计检测，激发光波长在530-560 nm之间，发射光波长为590 nm。

7. 普通分光光度计在570nm测定吸光度，参考波长600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

a）公式 3：通过吸光值来计算还原度的变化百分比

Alamar Blue 还原度变化百分比（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[( E600×P570)-（E570×P600）] ×100

E600=氧化态 Alamar Blue 在 600nm 波长的消光系数；

E570=氧化态 Alamar Blue 在 570nm 波长的消光系数；

A600=检测孔在 600nm 波长的吸光值；

A570=检测孔在 570nm 波长的吸光值；

P570=阳性对照孔在 570nm 波长的吸光值（不含待测药物的细胞+ Alamar Blue）

P600=阳性对照孔在 600nm 波长的吸光值（不含待测药物的细胞+ Alamar Blue）

结果判断：假如 Alamar Blue 还原度变化百分比（％）=62%，说明相对于对照孔，检测孔 Alamar Blue 的还原变化值为 62%，换句话而言，相对于对照孔，38%的检测孔细胞生长受到抑制。

b）公式 4：通过荧光值来计算还原度的变化百分比

Alamar Blue 还原度变化百分比（％）=（实验组 FI 590/阴性对照组 FI 590）×100 FI 590=590nm 发射波长（560nm 激发波长）下的荧光强度；

结果判断：假如 Alamar Blue 还原度变化百分比（％）=25%，说明相对于对照孔，检测孔 Alamar Blue 的 还原变化值为 25%，换句话而言，相对于对照孔，75%的检测孔细胞生长受到抑制。

运输与保存方法

保存：4℃避光保存，至少一年有效。运输：冰袋运输。

注意事项

1） 还原态的 Alamar Blue 在水或水溶性缓冲液如 PBS 中很不稳定，但在培养基内非常稳定。为了确定特定实验还原态 Alamar Blue 的吸光度/荧光值，需准备 100%还原态 Alamar Blue 试剂：将 Alamar Blue与细胞培养基（含血清）按照 1:10 的比例混合，121℃高压灭菌 15min 即可。由于荧光值定义比较随意，仪器不同荧光值都可能发生变化，因此，测定 100%还原态 Alamar Blue 荧光值时必须要和样本测定使用相同的仪器和培养基。

2） 适宜的细胞密度能够增加检测灵敏度。对于 96 孔板，建议每孔接种 100μl 细胞，细胞浓度范围：贴壁细胞为 100-10,000 个/孔，悬浮细胞在 2,000-50,000 个/孔，以培养基为空白对照。对于 384 孔板，细胞浓度和接种量均减半。

3） 影响细胞对 Alamar Blue 反应的两大变量为孵育时间和铺板密度，建议实验前需先摸索优化这两个因素。细胞密度过高或孵育时间过长都会导致继发性还原反应，红色产物停止增加并开始衰减，导致吸光度/荧光水平明显下跌并伴随红色消失。

4） 微生物污染会还原 Alamar Blue。因此对被污染细胞使用 Alamar Blue 检测会引起错误结果。

5） Alamar Blue 可以用分光光度计或荧光计检测，但荧光灵敏度高，实验误差小，推荐荧光检测。

6） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。